Proces dochodzenia biologicznego ojcostwa opiera się na wielu dziedzinach nauki począwszy od prawa, poprzez genetykę i biologię molekularną, a skończywszy na matematyce oraz statystyce. Dzięki postępom naukowym jakie dokonują się w ramach tych dyscyplin dysponujemy metodami, które spełniają dwa najważniejsze kryteria testu na ojcostwo, mianowicie pewność i wiarygodność otrzymanego wyniku. Droga do takiego rezultatu nie jest przypadkowa i rządzi się wypracowanymi przez lata zasadami, które muszą być rygorystycznie przestrzegane przez każde laboratorium wykonujące tego typu usługi. Jeśli ciekawi Was, jak „od kuchni” laboratoryjnej przebiega proces ustalania ojcostwa zachęcam zapoznanie się z dalszą częścią artykułu.

Aktualnie stosowana metoda badania ojcostwa

Aktualną metodę badania ojcostwa zawdzięczamy głównie osiągnięciom z zakresu genetyki i biologii molekularnej. Bowiem, podstawą analizy jest uzyskanie od osoby badanej kwasu deoksyrybonukleinowego – DNA, który jest nośnikiem wszystkich informacji, potrzebnych do ustalenia ojcostwa. DNA zlokalizowany jest głównie w jądrze komórkowym i znajduje się w każdej komórce ludzkiej, która takie jądro posiada. Fakt ten, pozwala na nieinwazyjne i bezbolesne pozyskanie materiału biologicznego od osoby badanej w postaci wymazu, czyli przeniesienia komórek nabłonka zawierających DNA, znajdujących się po wewnętrznej stronie policzka na pałeczkę wymazową. Następnie materiał biologiczny trafia do laboratorium, gdzie otrzymuje swój unikatowy numer, który zapobiega nie tylko pomyłce podczas analizy, ale takie chroni dane osobowe badanego.

Początkowym etapem analizy jest izolacja DNA, czyli jego „wydostanie” z komórki. Obecnie dysponujemy komercyjnymi zastawami odczynników chemicznych i enzymów, które pozwalają nam na szybkie
i wydajne przeprowadzenie tego etapu. Wbrew pozorom nie jest to łatwa sprawa. Natura tak zbudowała komórkę i jądro, żeby chronić nasz materiał genetyczny przed wszelkimi szkodliwymi czynnikami. Jednak za pomocą chemii, enzymów, podwyższonej temperatury i wirowania jesteśmy w stanie uzyskać „czysty” genomowy DNA.

Mimo tego, że metody izolacji kwasów nukleinowych są bardzo dobrze zoptymalizowane otrzymujemy małe ilości DNA i w związku z tym musimy zwielokrotnić jego stężenie w probówce. W tej kwestii niezbędnym narzędziem staje się nieoceniona łańcuchowa reakcja polimerazy, powszechnie znana jako reakcja PCR. Dzięki jej zastosowaniu mamy możliwość pozyskania milionów kopii wybranych fragmentów nici DNA. Reakcja jest laboratoryjną modyfikacją naturalnego procesu replikacji DNA, czyli kopiowania nici kwasu deoksyrybonukleinowego, który zachodzi w komórkach intensywnie dzielących się w naszym organizmie. Różnica polega na tym, że nie powielamy całego genomowego DNA człowieka, tylko wybrane jego fragmenty. W przypadku badań ustalania ojcostwa są to tzw. krótkie powtórzenia tandemowe STR (ang. Short Tandem Repeats) zawierające specyficzne sekwencje nukleotydów zlokalizowane w tzw. loci (miejscu) na chromosomie. Dzięki temu, że są one dziedziczne i rzadko ulegają mutacjom możemy je wykorzystywać nie tylko w badaniu ojcostwa, ale także w celach identyfikacji osobniczej i kryminalistyce. Reakcja PCR podobnie możliwa jest dzięki zastosowaniu gotowych zestawów do amplifikacji DNA. Zawierają one niezbędne elementy do przeprowadzenia tego procesu, tj. enzym polimeraza, wolne nukleotydy, jony magnezu, znakowane startery – krótkie odcinki DNA komplementarne (odpowiednio dopasowane) do matrycy DNA, które zapoczątkowują reakcję oraz woda i bufor utrzymujące odpowiednie warunki całego procesu. Etap ten odbywa się dzięki zastosowaniu różnicy temperatur odpowiednio raz wyższych, raz niższych i przebiega w urządzeniu tzw. termocyklerze w trzech etapach (Ryc. 1). Pierwszym z nich jest denaturacja, czyli podgrzanie DNA i składników reakcji do temperatury ok. 96^oC, która prowadzi do rozplecenia podwójnej helisy na dwie oddzielne nici. Kolejnym etapem jest obniżenie temperatury do ok. 50-60^oC, dzięki czemu do obu nici w odpowiednie miejsca przyłączają się startery. Ostatnim krokiem jest podniesienie temperatury do ok. 72^oC, co pozwala na dobudowywanie przez polimerazę wolnych nukleotydów do nici DNA i jej wydłużanie oraz kopiowanie. Każdy cykl składający się z tych 3 etapów powtarzany jest około 30 razy.

„Składanie” reakcji PCR przez laboranta jest czynnością niezwykle ważną i wymaga przestrzegania szczególnych procedur oraz zasad bezpieczeństwa, których celem jest zapobieganie kontaminacji, czyli zanieczyszczeniu próbek obym DNA.

Reakcja PCR wykorzystywana w procesie ustalania ojcostwa jest reakcją multiplex PCR. Co to oznacza? Otóż podczas jednej reakcji namnażanych jest nie jeden, ale aż 16 markerów STR, które następnie analizujemy poprzez rozdział elektroforetyczny. Jest to możliwe dzięki właściwości DNA, który jest naładowany ładunkiem ujemnym i podczas rozdziału w kapilarze dąży do dodatnio naładowanej elektrody. Poszczególne odcinki DNA powstałe dzięki reakcji multiplex PCR różnią się między sobą długością i kształtem. Te krótsze przemieszczają się szybciej po kapilarze i laser odczytuje ich sekwencje jako pierwsze. Detekcja odbywa się dzięki specjalnie wyznakowanym starterom wykorzystanym podczas reakcji PCR oraz aparaturze
w postaci analizatorów DNA. Są to niezwykle precyzyjne urządzenia, których czytniki laserowe, pozwalają nie tylko na uzyskanie niepowtarzalnych profili genetycznych domniemanego ojca, dziecka i matki w oparciu o sekwencje markerowe, ale również czytanie sekwencji DNA nukleotyd po nukleotydzie. Dane otrzymane z rozdziału są odpowiednio interpretowane za pomocą autorskiego oprogramowania komputerowego GeneMapper, które generuje wyniki w postaci elektroforegramu (Ryc. 2). Jest to profil genetyczny analizowanej osoby w postaci pików elektroforetycznych z określonymi wartościami liczbowymi, które odzwierciedlają allele, czyli odziedziczone po rodzicach warianty analizowanych sekwencji STR. Stanowi to osobliwą cechę każdego z nas, tzw. „genetyczny odcisk palca”.

Ryc. 2 Przykładowy wynik rozdziału 7 markerów STR badanej osoby.

Uzyskane wyniki w końcowych etapach badań wykorzystywane są do porównania, czy zgodnie z zasadami dziedziczenia połowa materiału genetycznego domniemanego ojca została przekazana dziecku oraz do procentowego obliczenia prawdopodobieństwa biologicznego ojcostwa między badanym mężczyzną, a badanym dzieckiem. Ustala się, czy jest ono na tyle wysokie, że można wydać wynik graniczący z pewnością lub definitywnie wykluczyć ojcostwo. Analizę statystyczną również przeprowadza się w specjalnych programach komputerowych zgodnie z zaleceniami Polskiego Towarzystwa Medycyny Sądowej
i Kryminologii. Zakończeniem badania jest sprawozdanie, które zawiera opis przeprowadzonej analizy, profile genetyczne badanych osób, rezultat obliczeń statystycznych, słowną interpretację wyników oraz podpisy i pieczątki osób, które całą procedurę wykonały i zatwierdziły.

Wszystkie etapy procesu ustalania ojcostwa podlegają zasadom walidacji, optymalizacji i jakości usług. Laboratorium powinno dążyć do uzyskania certyfikatów, w tym najważniejszych jakimi są akredytacja i GEDNAP, aby klient miał świadomość i pewność, że zarówno jego materiał genetyczny jak i sama analiza trafiły w „dobre i nieprzypadkowe ręce”.